Una quantità ragionevole di domande e risposte su CRISPR-Cas9

*a meno che non siate biologi/biotecnologi, in tal caso è sta roba non è neanche vagamente abbastanza.

Ci sono già un milione di articoli divulgativi su sto tema, fatti più o meno bene; volevo però un archivio con qualcosa che sia che salti fuori un quindicenne interessato che uno che fa la magistrale di biotecnologie, posso copiargli parti diverse di sto articolo, e qualcosa ci capisce.

Ragion per cui la forma è in botta & risposta, potete vedere quello che vi interessa di più saltando qui e là. Se cliccate sulla domanda, si apre la tendina sotto con la risposta.

NB: Work in progress. Ci sono tante altre domande che conto di aggiungere qui (Tipo, roba su cos’è un gene drive, qualcosa sulla regolamentazione, qualcosa su uso somatico vs embrionale, le PGM con CRISPR, una breve storia delle scoperte rilevanti che non sia scritta da uno che deve vincere un processo sulla parternità e ha giganteschi conflitti di interesse in merito, e anche altre cose, ma volevo qualcosa di scritto oggi con una bibliografia per la live su link2universe. L’altro lato positivo è che così effettivamente posso fare crowdsourcing delle domande).
Ma insomma, cos'è sto CRISPR?

 

CRISPR (si legge crisper) o meglio, CRISPR-Cas9, è una nuova rivoluzionaria tecnica di ingegneria genetica che, utilizzando pezzi presi dal sistema immunitario dei batteri, permette di tagliare qualsiasi pezzo di qualsiasi genoma di qualsiasi organismo con una precisione superiore a qualsiasi altra tecnica mai scoperta. Si può usare in vitro, in cellule, in vivo, su tutto dai virus alle piante all’uomo. Costa pure poco, e la combinazione di ste due ne ha già fatto, a 5 anni dalla sua scoperta, una delle tecniche più rivoluzionarie nella storia della biotecnologia.

No, sul serio, spiegami per bene cos'è sto CRISPR-Cas9, non ste cose da giornalaio

 

CRISPR sta per Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, cioè brevi sequenze palindromiche raggruppate in gruppi regolarmente spaziati. Queste sequenze sono state scoperte in archea (e poi in batteri) ed è saltato fuori (circa 15 anni dopo) che fanno parte di un sistema immunitario che usano i batteri contro i virus. In breve: un virus che si pappa un batterio (un batteriofago), gli inietta il suo DNA, e cerca di prendere il controllo della cellula per produrre altre copie del virus. Il sistema CRISPR del batterio sminuzza quel DNA, e lo infila in quelle regioni CRISPR del suo stesso genoma. Il batterio a questo punto è “vaccinato”: da quella regione del DNA stamperà delle guide di RNA, che si infilano in proteine dette Cas, perché CRISPR-Associated. La combo Cas+RNA andrà in giro per la cellula a confrontare la sua guida con il DNA che trova: se c’è una corrispondenza, ZAC! il DNA virale viene tagliato e non può fare il suo sporco lavoro di sabotaggio.

Abbiamo poi scoperto che questo sistema funziona anche in vitro, semplicemente con una singola proteina del sistema CRISPR, Cas9, a cui diamo noi direttamente dell’RNA di nostro interesse. E dopo che abbiamo visto che funziona in vitro, con un paio di aggiustamenti, siamo riusciti a vedere che funziona anche negli eucarioti, e più o meno ovunque lo metti. Hai bisogno solo di 3 condizioni: un RNA guida che punta ad un bersaglio, la proteina Cas9, e che di fianco alla sequenza bersaglio ci sia una breve sequenza di DNA a cui Cas9 possa legarsi, che si chiama PAM.

Slide rubata dalle lezioni di Doug Mortlock, Vanderbilt University School Of Medicine. CC-BY-SA 3.0

 

Dai, vacca boia, ho due lauree, non prendermi per il culo con queste cose da cartone animato. T'ho detto che voglio sapé cos'è CRISPR.

 

Ci sono vari tipi di sistemi CRISPR/Cas; quello più popolare, e di maggiore interesse per l’ingegneria genetica finora, è il tipo II. Per chiarezza, prima spieghiamo come funziona nei batteri, poi vediamo come l’abbiamo riciclato nei sistemi ingegnerizzati.

Nel genoma di Streptococcus pyogenes, il batterio con CRISPR di tipo 2 da cui siamo partiti per avere la versione ingegnerizzata, il locus CRISPR è composto da:

-una sequenza tracr
-Cas9, Cas1, Cas2, i geni per le CRISPR-associated proteins (Cas). Tutti i sistemi Cas di tipo 2 hanno Cas1 , Cas2 ma ce ne sono altre “opzionali”. Alcuni non usano Cas9 ma altre nucleasi simili.
-La parte di genoma in cui vengono conservate le sequenze precedentemente incontrate: sequenza palindroma-spaziatore-sequenza palindroma.

Vediamo che succede quando S. pyogenes viene attaccato da un batteriofago. Il fago inietta il suo DNA nel citoplasma del batterio. Cas1 e Cas2 sono già nel citoplasma, legate tra di loro, e passano in rassegna il DNA libero. Quando trovano una sequenza specifica, che nel caso di S.pyogenes è NGG, tagliano un segmento di 23 basi dal genoma virale, dopodiché lo integrano nel genoma batterico, duplicando una delle sequenze palindrome. In pratica si avrà di nuovo palindromo-spaziatore-palindromo, dove lo spaziatore è la sequenza virale appena inserita.

Da quella parte del locus si prepara l’RNA che dirà specificamente a Cas9 cosa tagliare.
In primo luogo, viene trascritto un RNA che contiene le ripetizioni palindrome e gli spacer; lo chiamiamo pre-crRNA (Pre-Crispr-RNA). Contemporaneamente, dalla sequenza tracer, viene trascritto il tracrRNA (che sta per Trans-activating crispr-RNA).
Il tracrRNA si ripiega tridimensionalmente a formare una struttura che è riconosciuta e legata da Cas9. Il tracrRNA contiene anche una sequenza che è complementare alle ripetizioni palindrome del CrRNA, per cui quando le due si avvicinano, si forma un RNA duplex tra il 3′ del pre-crRNA e il 5′ del tracrRNA, che è sempre legato a Cas9. Abbiamo quindi un complesso pre-crRNA-tracrRNA-Cas9. La formazione di questo complesso viene riconosciuta dalla RNAsi 3, che taglia il pre-CrRNA a valle delle ripetizioni palindrome, producendo tanti piccoli crRNA maturi che restano legati a Cas9 tramite il tracerRNA.

La versione legata di crRNA matura e tracrRNA, prende il nome di gRNA (o guide RNA), e siccome è già caricato su Cas9, può essere da subito utilizzato per andare a caccia del bersaglio.

Uno schemino riassuntivo da Nature Methods con lo schema del locus e come funziona l’acquisizione e l’implementazione dell’immunità

Quando il prossimo fago prova ad iniettare il suo DNA a doppio filamento, Cas 9 lo srotola e lo confronta con il gRNA. Se le sequenze sono identiche e a valle delle zone che combaciano c’è una specifica sequenza, Cas9 utilizza i suoi domini endonucleasici per creare una doppia rottura di filamento. La sequenza specifica che deve essere presente si definisce PAM, protospacer adiacent motif, e per Cas9 di Streptococcus pyogenes è semplicemente NGG. Questa sequenza PAM è fondamentale perché Cas9 eviti una “reazione autoimmune”, cioè non impari per sbaglio a tagliare il DNA batterico in cui è stato incluso il DNA virale tra gli spacer. Se sia l’RNA che il PAM combaciano, Il DNA virale viene spezzato e neutralizzato, e può essere poi degradato da altre nucleasi cellulari che non necessariamente fanno parte del locus di CRISPR.

Una volta che Cas9 è carico con il suo gRNA, però, non serve null’altro, e si può usare per fare tagliare quello che si vuole in qualsiasi sistema, il che semplifica la situazione in un sistema ingegnerizzato. Non c’è bisogno, infatti, di inserire tutti i geni e tutte le sequenze all’interno della cellula bersaglio, ma soltanto Cas9 e una singola sequenza che diventerà gRNA. Non c’è insomma (quasi mai) bisogno di mettere tutto l’ambaradam e far maturare l’RNA nella cellula: si usa direttamente una sequenza leggermente modificata del gRNA già assemblato, l’sgRNA (Single guide RNA).

Se si usa, ad esempio, un plasmide, avremo la cassetta per l’espressione di Cas9 o di una delle sue varianti, un gene reporter e una cassetta per l’RNA guida in cui voi dovete solo aggiungere le 20 basi bersaglio, di solito tramite semplice procedimento enzima di restrizione/ligasi/clonaggio.

A quel punto dovete infilare in qualche modo il plasmide nella vostra cellula bersaglio, e anche lì si fa negli stessi modi in cui infilereste qualsiasi altro plasmide, che sia shock termico, elettroporazione o quello che è.

Di solito si tende ad usare promotori costitutivi, quindi una volta dentro la cellula Cas9 e il sgRNA verranno sempre prodotti e cominceranno subito ad andare a colpire il vostro bersaglio. I tagli indotti da Cas9 in organismi eucarioti sono riparati tramite i normali sistemi, ricombinazione omologa o Non Homologous End Joining, il che permette di creare inserzioni, delezioni e sostituzioni al sito bersaglio a seconda di quello che vi serve. Ovviamente, se dovete inserire un pezzo di DNA esogeno tramite homologous recombination repair, oltre al plasmide con CRISPR che colpisca la sequenza bersaglio, vi serve un secondo plasmide, o vettore virale, o altro, che abbia un segmento di DNA con due braccia omologhe al bersaglio e la vostra sequenza estranea di interesse nel mezzo.
Altra cosa: nei sistemi ingegnerizzati, specialmente nelle cellule di mammifero, raramente si usa pyCas9 (cioè Cas9 di pyogenes) ma versioni modificate o ingegnerizzate, tipo varianti nickasiche come Cas9n, magari utilizzate in coppia per migliorare la precisione o attivare specificamente il tipo di riparazione che volete.

 

Okay, ho vagamente capito che CRISPR-Cas9 è una 'forbice', e quindi 'taglia', ma non mi è chiaro come 'incolla'. Me spieghi?
Crispr/Cas9 non incolla una ceppa di niente. Il DNA nelle cellule si lesiona comunemente nella vita di ogni giorno: ad esempio i raggi ultravioletti del sole possono spezzare i filamenti in 2 in maniera simile a quello che fa la proteina Cas9. Per proteggere la cellula da questi danni, si sono evoluti tutta una serie di meccanismi di riparazione del DNA. Negli eucarioti, cioè io, te, le piante, gli animali, i lieviti e più o meno tutto quello che ti viene in mente che non siano i batteri, il metodo più preciso di riparazione del DNA è la riparazione per ricombinazione omologa. Un sistema di proteine cerca una sequenza identica, o quasi identica, a quella che si è appena spezzata, e la usa come “stampo” per riparare o la integra direttamente per crossing over.
Se gli dai tu la sequenza quasi identica che vuoi, riesci a fregarlo e fargli includere il DNA che vuoi tu.


 

Sì, vabbé, ma io non ho capito che mi cambia a me che non sono uno scienziologo. Vabbé, sto coso taglia posti specifici nel DNA, e quindi? A che mi serve?
A tantissime cose diverse, molte delle quali sono ancora difficili da immaginare, e non è chiaro quali saranno commercialmente permesse o meno. Alcuni esempi, però, per darti un idea: prendere i tuoi globuli bianchi e modificarli con CRISPR, di modo che il tuo stesso sistema immunitario possa sconfiggere un tumore senza chemioterapia. Creare terapie riparative per malattie genetiche, come la distrofia muscolare, anche negli adulti. Impedire alle zanzare di trasmettere la malaria, e fermare altre malattie trasmesse da insetti, tramite gene drive. Impedire all’HIV di moltiplicarsi ed infilarsi in altre cellule, essenzialmente eliminandolo in pazienti malati di AIDS. Utilizzare CRISPR per modificare le cellule staminali ematopoietiche, per il trattamento dell’anemia falciforme e della beta talassemia. Usare batteri e lieviti come biofabbriche per nuovi composti, come facciamo ora per l’insulina, dai biocarburanti, alle bioplastiche. Creare una nuova generazione di piante geneticamente modificate, resistenti a malattie devastanti come la ruggine del frumento.

 

Aspetta, io sono una scienziologa invece. Per cosa lo posso usare io CRISPR che non siano le solite noiose, pragmatiche e materialiste applicazioni commerciali?

 

Oh, amica mia, hai un sacco di cose con cui puoi divertirti. Vuoi fare il knockout di un gene per capire a cosa serve? Puoi usare CRISPR. Vuoi fare il knock out di tanti geni contemporaneamente e vedere cosa succede? Multiplexing con CRISPR. Come cambia il folding di una proteina se cambio quello specifico aminoacido? Mutagenesi sito-specifica con CRISPR. Ma se sopprimo l’espressione di un gene, invece di romperlo? Mannò, ma non devi più usare l’RNAi, ci sono versioni di CRISPR che bloccano la trascrizione, anche in multiplex. Stai cercando di capire dove migrano e si differenziano certe cellule durante lo sviluppo embrionale di Triboleum castaneum? Inietti CRISPR+GFP nell’uovo, te guardi lo sviluppo embrionale al microscopio a fluorescenza che Star Wars levati. Il tuo lab sta con le pezze al culo e non te danno neanche i soldi per i reagenti? Fai le stesse cose che facevi prima, ma nella grant proposal scrivi che le farai con CRISPR e che il tuo studio sui segnali chimici emessi dalle lumache durante l’accoppiamento potrà dare nuovi processi brevettabili per l’uso di tecnologie di editing negli eucarioti, e improvvisamente avrai più chance di ottenere quei fondi.

 

Tutti dicono che il sistema CRISPR-Cas9 ha una precisione senza precedenti, ma quanto è preciso?

 

CRISPR-Cas9 riconosce una sequenza di 22 paia di basi, del tipo: NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG
Cioè 20 nucleotidi che vuoi tu, seguiti da 2 guanine. Sulla carta, in teoria, una sequenza di questo tipo appare per caso ogni 4^22 paia di basi, cioè ogni 1.7×10^13 basi, cioè circa ogni ventimila miliardi di basi. Ad esempio, il genoma umano è lungo circa 3 miliardi di basi, per cui, sempre sulla carta, è quasi impossibile che ci siano due sequenze dello stesso tipo. All’atto pratico, però, i genomi sono il risultato di duplicazioni, inversioni, ripetizioni e tutta una serie di processi evolutivi che rendono bersagli non voluti più frequenti del normale, ma progettando il bersaglio per bene si dovrebbero poter evitare effetti “off-target”, fuori bersaglio. Progettandolo male, ovviamente c’è il problema opposto: certe sequenze vengono riconosciute e il DNA tagliato da Cas9 anche se ci sono fino a 5 basi diverse tra guida e bersaglio.

 

Se per funzionare Cas9 vuole sempre un NGG a valle, non si può usare esattamente dove vogliamo, no?
Sì e no. Si possono usare strategie differenti per convincere Cas9 a tagliare anche se non c’è quel PAM, come usare promotori differenti nel vettore da cui vengono trascritti gli RNA. L’altra alternativa, è non usare spCas9, ma versioni differenti. Ci sono già sul mercato varianti di Cas9 ottenuti tramite evoluzione artificiale e ingegneria proteica che riconoscono PAM diversi, tra cui NGA, NGCG, NNGRRT e NNHRRT. Oppure, si può ignorare completamente Cas9, e cercare tra i sistemi immunitari di altri batteri; un esempio famoso di endonucleasi alternativa è Cpf1, che è più piccola, riconosce come PAM la sequenza TTN e invece di rompere l’intero filamento dritto fa un taglio “a zig-zag” (tecnicamente sono sticky ends).

 

Okay, Cas9 è una anche un'endonucleasi e quindi taglia il DNA quando l'RNA guida riconosce una sequenza bersaglio, ma più nel dettaglio come funziona sta cosa?

 

Cas 9 è una proteina b-lobata, una specie di pacman con una singola elica ponte che tiene le due metà insieme. Cas9 e le sue principali varianti hanno non uno, ma 2 domini con attività endonucleasica: il primo è vicino all’n-terminale della proteina, ed è quello RuvC-Like; il secondo è nel “cuore” della proteine, ed è HNH-like. Al C-terminale c’è PI, il dominio che riconosce il PAM, protospacer adiacent motif, cioè la sequenza di poche basi che deve stare a fianco alla sequenza bersaglio. Quando sia l’RNA guida che PI sono legati alla sequenza giusta, la proteina va in contro ad un massiccio cambiamento conformazionale, e i due domini endonucleasici si riposizionano e tagliano separatamente i due filamenti nello stesso punto, a 3 nucleotidi a monte di PAM.

La struttura 3D di Cas9 in forma”chiusa”; in rosso l’RNA, giallo e verde i due filamenti di DNA
By Cas9 wiki project – Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=37270544

 

Com'è che funziona sta roba di usare CRISPR-Cas9 per curare certi tumori? Stanno già facendo dei test in uomo?
Sì, ci sono già due test clinici in atto, uno in USA e uno in Cina, che stanno cercando di usare una tecnica in uomo basata su CRISPR per il carcinoma al polmone. Sì è riusciti ad arrivare in uomo relativamente infretta perché, per farla breve, è un tipo di immunoterapia su cui già si stava lavorando da anni, che però è diventata improvvisamente più accessibile e meno costosa grazie a CRISPR.

I linfociti T sono un tipo di globuli bianchi che, tra le altre cose, possono riconoscere e uccidere cellule tumorali. L’attivazione dei linfociti T contro i tumori è regolata da tantisssimi segnali chimici, ma il modo principale in cui il linfocita T impara a scegliere il bersaglio è quando un’altra cellula del sistema immunitario (di solito una cellula dendritica o un macrofago), gli “presenta l’antigene”. Ovviamente, non vuoi che i linfociti T scambino le altre cellule del sistema immunitario per qualcosa da distruggere solo perché hanno un antigene, ragion per cui, i linfociti T hanno sulla loro superfice un recettore che si chiama PD-1, che significa “Programmed Death-1”, mentre le altre cellule del sistema immunitario hanno PD-1L, cioè “Programmed Death-1-Ligand, cioè una proteina che sporge dalla cellula e si lega a PD1. Quando il linfocita vede un antigene, prima di dire “decolliamo e nuclearizziamo”, deve controllare che il suo P1D non ha qualcosa con cui legarsi e che non stia facendo fuoco amico.

Purtroppo, le cellule tumorali evolvono, e dopo un po’ cominciano anche loro ad esprimere PDL1 sulla superficie, fermando i linfociti T dall’ucciderle. Dagli anni 90′ in poi, per cercare di migliorare la situazione, si usano per i pazienti anticorpi che vanno a bloccare PD1 sui linfociti T, impedendogli di riconoscere PD-1L. Alcuni esempi di questi anticorpi già sul mercato sono il Nivolumab e il Pembrozulimab, che vengono utilizzati specialmente per le recidive, quando il tumore ha già “imparato” ad evadere il sistema immunitario.

Uno schemino piccino picciò da Nature Biotecnology di come funzionano gli anticorpi anti-PD1. Qui me la cavo con il fair use perché è un’anteprima piccina e educational purposes. Se cliccate e avete gli accessi potete vederla grandicella

I testi clinici che sono in corso con CRISPR-Cas9 in Cina e all’Università della Pennsylvania in USA usano lo stesso principio, cioè rimuovere il freno inibitore ai linfociti T. Si prendono i linfociti T dal paziente, e, in vitro, si usa CRISPR per tagliare via il gene che produce PD-1, dopodiché li si reinietta. Siccome si usano gli stessi linfociti del paziente, non c’è rischio di rigetto.

I trial in questione sono in fase 1, cioè la primissima fase in uomo, per cercare di capire soprattutto quanto la terapia è tollerabile. Perché, ovviamente, spegnere PD-1 significa si che i linfociti funzioneranno meglio contro il tumore, ma rischiano anche di scatenare reazioni anti-immuni. In linea di principio il fatto che si vada ad agire direttamente sulla cellula, invece di dover usare anticorpi che nel sangue devono trovare il bersaglio e legarlo, dovrebbe permettere lo stesso effetto curante a “dosi”, e quindi con effetti collaterali, minori, ma nei fatti è tutto da vedere.
Ci sono ovviamente altre strategie simili, che modificano i globuli bianchi perché possano eliminare il tumore da soli, come i CAR-T e tanti altri, ma questa strategia è finora la più avanzata nell’iter della ricerca clinica.

 

Cos'è sta cosa dei CAR-T e dei globuli bianchi modificati per la lotta al cancro?
I linfociti T, un tipo di globuli bianchi del vostro sistema immunitario, possono uccidere le cellule tumorali. Riconoscono le cellule tumorali grazie ad un recettore (TCR) che sta sulla superficie della cellula. Durante la maturazione dei linfociti, le sequenze geniche che codificano per il TCR vengono spontaneamente editate, tagliate e modificate, di modo che ciascun linfocita abbia un TCR differente. Prima però che queste cellule immunitarie vengano messe in servizio, si verifica che il loro recettore non si leghi alle stesse cellule dell’organismo: se ciò succede, cioè c’è “autoimmunità”, i linfociti T si suicidano.

Le cellule cancerose sono cellule impazzite, vero, ma sono comunque cellule impazzite dello stesso paziente. Ragion per cui i linfociti T tendono a essere poco aggressive e non attaccarle e distruggerli. Da qualche anno era già in via di sperimentazione una tecnica basata sul modificare questi linfociti T. Si aggiungeva, in un punto casuale del genoma, un secondo recettore, detto CAR (che sta per chimeric antigen receptor) progettato in laboratorio per riconoscere specificamente le cellule tumorali che normalmente il sistema immunitario scambierebbe per innocenti. Questi linfociti si chiamano CAR T, e per ora si sono ottenuti più che altro con altre tecniche di modifica genetica, partendo direttamente dai linfociti dei pazienti.

La tecnica funziona, e ci sono già casi di leucemie curate tramite questa strategia, ma ha dei problemi. Il primoe è che, quando la cellula esprime sia TCR che CAR, dopo un po’ va in “esaustione”: in pratica crede di essere iperattiva, e comincia ad esprimere segnali inibitori, il che significa che tende ad essere meno efficace contro i tumori solidi, come il carcinoma. Il secondo è che quando le cellule credono di essere sempre attive, rilasciano sempre segnali chimici d’allarme (citochine e interleuchine), che causano altissimi livelli di infiammazione e finiscono per uccidere i linfociti stessi. Tramite CRISPR, però, possiamo prendere il genoma del linfocita T e andare a inserire il nostro CAR proprio dove ci sono i geni per il TCR. In questo modo il linfocita modificato avrà solo il CAR al posto del TCR, risolvendo in larga parte il problema dell’esaustione, e lo farà solo quanto esprimerebbe il TCR, risolvendo il problema della super allerta del sistema immunitario.

 

E la leucemia? Ho sentito la storia di una bambina curata dalla leucemia con CRISPR. Come hanno fatto?
A gennaio 2017 è stato dato l’annuncio che nel Regno unito, due bambine malate di leucemia, una di 11 mesi e una di 16 mesi, per cui le terapie tradizionali non avevano sortito effetto, sono andate in remissione completa grazie alla terapia genica in soli 28 giorni. Prima precisazione: non si è trattato di CRISPR: si è utilizzata un’altra tecnica di ingegneria genetica, un po’ più vecchia, i TALENS, che funzionano in maniera leggermente diversa da CRISPR ma in ultima analisi fanno la stessa cosa: tagliano un punto preciso del genoma. Hanno utilizzato la tecnica dei CAR-T, che è spiegata da un’altra di questo articolo, vatti a cercare la domanda. Seconda precisazione: non è chiaro se il merito sia stato tutto dell’editing genetico, o della combinazione chemioterapia/terapia genetica. Terza precisazione: al contrario del caso “normale” di CAR-T, dove le cellule vengono dal paziente, in questo caso si sono usati i linfociti di donatori compatibili.

 

Ho capito che per l'ingegneria genetica CRISPR-Cas9 è la nuova cosa importante per l'ingegneria genetica ne i prossimi 15 anni, ma in natura? Conta qualcosa o è una curiosità?
Solo la metà dei genomi batterici che abbiamo sequenziato contengono sistemi CRISPR-Cas9, e diversi ceppi batterici della stessa specie spesso differiscono molto nella presenza, e lunghezza, dei loro geni CRISPR. A prima vista, ciò è strano: perché la metà dei batteri non dovrebbe avere un sistema immunitario adattativo?

Sia modelli teorici che studi pratici ci dicono che i sistemi CRISPR possono sparire molto velocemente, a seconda dell’ambiente in cui i batteri abitano. Ad esempio, Mycoplasma gallosepticum, un batterio con un genoma piccolissimo, ha perso il suo sistema CRISPR quando è passato dal parassitare polli ai passeri.
Da un punto di vista ecologico, possiamo fare le qualche osservazione, per provare a capire alcuni degli ambienti in cui CRISPR-Cas è più vantaggioso.
1) Sebbene ci siano batteri con sistemi CRISPR-Cas in luoghi tanto diversi quanto il cavo orale umano alle bocche vulcaniche sottomarine ai laghi ultrasalini agli scarichi acidi delle miniere, batteri con CRISPR sono più frequenti in ambienti con temperature relativamente alte, e in particolari i batteri termofili hanno tendenzialmente porzioni più grandi del genoma dedicate ad un sistema CRISPR
2) Tanto più in un ambiente c’è varietà di virus, tanto meno CRISPR è utile. Il sistema infatti è altamente specifico ma solo contro virus già incontrati precedentemente. Se c’è grande varietà di virus, il costo di mantenere CRISPR, e il rischio di una “reazione autoimmune”, cioè che CRISPR impari a colpire una sequenza virale che per caso è naturalmente presente nel genoma batterico, diventa sempre più alto.
3) La presenza di mutualisti. Se è palese che avere un sistema che riconosce DNA estraneo come CRISPR per difendersi dai fagi è utile per difendersi da questi malintenzionati, non è così chiaro che questo sia così anche quando nell’ambiente c’è DNA mobile che potrebbe essere utile per il batterio, come resistenze agli antibiotici. Ci sono casi in cui CRISPR conferisce immunità non solo contro batteriofagi ma anche contro plasmidi e trasposoni. Ad esempio, in Enterococcus faecium e Enderococcus fecalis, che (guarda un po’ chi l’avrebbe mai detto dal nome non si capisce proprio) sono due batteri delle feci tra le più comuni cause di infezioni ospedaliere secondarie, la presenza di CRISPR è inversamente correlata con la presenza di resistenze antibiotiche.

 

Momento momento momento, sono stato morso da Marco Ferrari in una notte di luna piena, quindi vedo l'evoluzione ovunque. Come si è evoluto il sistema CRISPR? Non può essere mica saltato fuori dal nulla.
Ci sono un fottio di sistemi CRISPR-Cas, molto diversi tra loro. Si dividono in 2 classi, 6 tipi, e 19 sottotipi, anche se quelli più studiati sono quelli di tipo 2, di cui fa parte Crispr-Cas9. Nonostante questa grande diversità, tutti i batteri e gli archea che hanno un sistema immunitario basato su CRISPR hanno le ripetute palindromiche spaziate da cui prendono il nome e immediatamente adiacenti nel genoma, un set di geni cas, cioè Crispr-Associated. Per quanto Cas9 sia la più famosa, le due proteine Cas più conservate, cioè più presenti nei vari batteri e archea, sono Cas1 e Cas2, che all’interno del batterio sono quelle che prendono il segmento di DNA virale e lo includono nel genoma batterico. Proprio perché Cas1 e Cas2 sono le più conservate, possiamo usarle per cercare di costruire la genealogia di CRISPR e cercare proteine simili di cui potrebbero essere discendenti. Negli archea, sono stati individuati istanze di pezzi di genoma con Cas1 e basta (denominati Cas1-solo), che spesso si trovano dentro trasposoni, segmenti di genoma che alle estremità hanno segmenti ripetuti e invertiti, e che possono balzare qua e là da un genoma all’altro. Per questo motivo, si sospetta che questi casposoni possano essere stati in qualche modo dei precursori del sistema CRISPR e che si siano diffusi largamente per transferimento orizzontale, invece che per discendenza. Il passaggio ad un vero e proprio sistema Cas è potuto avvenire tramite l’integrazione di una proteina progenitrice di Cas-10, che già probabilmente aveva una funzione immunitaria, anche se non “imparava” dal DNA del nemico. I dettagli del processo, e di come poi si siano differenziati in varie famiglie, sono ancora poco studiati, ma probabilmente dipendono da quali endonucleasi erano già presenti per altre ragioni, e sono state incluse e riciclate nel sistema CRISPR.

Uno schema del possibile differenziamento dei sistemi CRISPR a partire dai casposoni. Da Evolution And Ecology Of Crispr, Westra et al, cfr bibliografia

 

Se i sistemi CRISPR si sono evoluti nei batteri per difendersi dai fagi, ci sono fagi che hanno sistemi anti-CRISPR?

 

Ebbene sì: ad esempio molti fagi che colpiscono batteri del genere Pseudomonas hanno nel loro genoma o una proteina che si lega al complesso Cas-RNA guida per impedire di farsi identificare, o direttamente alla nucleasi Cas3 per bloccare il taglio del DNA. Queste proteine sono però molto più rare dei sistemi Crispr-Cas, per il semplice motivo che il modo principale tramite cui i fagi evolvono per sottrarsi a CRISPR sarà la ben più immediata mutazione puntiforme di una o poche basi nella sequenza che viene riconosciuta dal sistema immunitario del batterio.

 

Non è che per caso hai scritto un articolo che spiega in maniera breve ma esaustiva la disputa brevettuale su CRISPR tra Doudna+Carpentier vs Zhang fino, diciamo, al risultato della prima sentenza, e come l'assegnazione di questo brevetto può influenzare lo sviluppo delle cure basate su questa tecnologia?

 

Certo, fittizio-e-del-tutto-ipotetico-amico-che-mi-fa-domande comode. Lo trovi su Motherboard Italia: Chi sta vincendo la guerra civile sul brevetto CRISPR?

 

La fai facile metti CRISPR-Cas9 nella cellula, ma come si fa più praticamente?

 

Beh, in linea di massima, ci sono 3 modi. Il primo è il metodo quello fisico: quando hai roba sufficientemente robusta, tipo il caro E. coli o cellule analoghe, puoi usare shock termico o elettroporazione per rendere momentaneamente la membrana cellulare abbastanza permeabile perché riesca ad entrare il tuo plasmide con i geni per CRISPR. Ma per certe cose più delicate, non lo puoi fare: ad esempio, se vuoi infilare il DNA che produrrà Cas9 con il suo bersaglio in un embrione, puoi usare delle tecniche di microiniezione, che sono esattamente quello che ti aspetteresti dal nome.

Se però vuoi infilare il tuo sistema CRISPR in tessuti, e non organismi unicellulari o embrioni, tipicamente dovrai usare vettori virali. l vettori virali sono virus di cui è stato preso il genoma, rimosso quasi tutto tranne quello che serve ad impacchettare il DNA e iniettarsi nelle cellule, e sostituito con quello che ti interessa. I principali tipi di vettori sono versioni modificate di lentivirus, gli adenovirus, e i virus adeno-associati, ma in casi speciali si usa anche il virus dell’herpes simplex come vettore. Siccome i virus sono cavalli di troia naturali, il cui scopo è iniettare il loro genoma in una cellula e convincerla a fare altri virus, se scegli bene il vettore giusto per i tuoi interessi, il sistema funziona abbastanza bene. Il problema è che sono pur sempre virus, per cui se questa pratica in tessuti ex-vivo normalmente non dà alcun problema (ad esempio le modifiche di CAR-T altrove in questo articolo si ottengono così) la tossicità in-vivo è una grande preoccupazione, specialmente in combinazione con queste tecniche di modifica genetica.

Con CRISPR/Cas, in particolare, c’è un altro problema: la versione di Cas9 più comune, spCas9, è troppo lunga! Il solo gene per produrre Cas9 è più lungo dell’intero genoma dei vettori adenovirali. Ci sono diverse strategie per risolvere il problema, tra cui usare parenti più piccoli di spCas9, come saCas9, che viene dallo stafilococco aureo, o versioni ingegnerizzate di modo da potersi assemblare come transformers quando due pezzi separati iniettati da due virus si trovano nella stessa cellula (intein-mediated Cas9). Con strategie simili abbiamo riparato i geni della distrofia muscolare di duchenne in topi, quindi per quanto sia difficile, la tecnica è molto promettente.

Infine, si possono utilizzare vettori non virali: liposomi, che sono praticamente microscopiche sfere degli stessi grassi che compongono membrana cellulare che si fondono con il resto della cellula quando entrano in contatto con il bersaglio. Oppure nanoparticelle di polimeri, in pratica sferette di plastica, che si dissolvono solo all’interno della cellula e che contengono il DNA che vogliamo consegnare. Il problema di queste strategie è che, specialmente se confrontate con i virus, che hanno imparato in miliardi di anni a bersagliare e infilarsi nelle cellule, sono meno specifici (al contrario dei virus, che invadono solo certi tipi di cellule), meno efficenti ad entrare, ed anche una volta che il DNA è dentro la cellula questa tende ad esprimere poco quei geni. Il vantaggio è che sono completamente atossiche e biocompatibili, per cui non incorrono nel rischio di causare una risposta immunitaria nel paziente. E, nel caso di CRISPR-Cas9, puoi progettarli perché ci stia dentro tutto senza bisogno di assemblaggio dopo la consegna.
Secondo il Gene Therapy Clinical Trials Worldwide Database del Journal of Gene Medicine, dei quasi 300 test clinici per terapie geniche effettuati tra il 1989 e il 2016 utilizza, il 70% usa vettori virali e solo 2 (non il 2%, 2 su 3000) usano vettori non virali, con il resto tramite metodi fisici o altre strategie. D’altro canto, i vettori non-virali sono stati messi a punto in tempi relativamente recenti, per cui questo non va letto come “i vettori non-virali sono una causa persa”, solo che quelle tecnologie sono ancora un po’ acerbe.

 

 

Bibliografia
Wright, A. V., Nuñez, J. K. & Doudna, J. A. Biology and applications of CRISPR systems: harnessing nature’s toolbox for genome engineering. Cell 164, 29–44 (2016)
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“The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea”
https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.molcel.2009.12.033
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In Vivo Delivery Systems for Therapeutic Genome Editing, Review, International Journal Of Molecular Sciences
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4881452/
Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells http://stm.sciencemag.org/content/9/374/eaaj2013
A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.
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Evolution and Ecology of CRISPR Annu. Rev. Ecol. Evol. Syst. 2016. 47:307–31
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Making Better Chimeric Antigen Receptors for Adoptive T-cell Therapy.
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Jensen, M. C. & Riddell, S. R. Designing chimeric antigen receptors to effectively and safely target tumors. Curr. Opin. Immunol . 33, 9–15 (2015)
http://dx.doi.org/10.1016/j.coi.2015.01.002
Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection
http://www.nature.com/nature/journal/vaop/ncurrent/full/nature21405.html
Therapeutic uses of anti-PD-1 and anti-PD-L1 antibodies.
Int Immunol. 2015 Jan;27(1):39-46. doi: 10.1093/intimm/dxu095. Epub 2014 Oct 16
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25323844
  1. Nimes Franchi

    Articolo fantastico perché permette di conoscere la realtà dei fatti andando oltre i titoli ingannevoli di certa stampa che fa apparire tutto semplice e di non lontana realizzazione. Sono affetta da poliposi adenomatosa familiare, ho la certezza che nella vita svilupperò un tumore al colon ed alte percentuali per tumori desmoidi,alla tiroide, al pancreas, allo stomaco, al seno, alle vie biliari. Si tratta di una patologia rara di difficile gestione. Chiedo gentilmente se il sistema CRISPR un giorno potrà aiutare le persone affette dalla mia patologia . Vi ringrazio tantissimo.

    • Tenendo presente che non sono un medico, che i tumori sono molto lontani dall’essere la mia specialità, etc etc, ho guardato un po’ in letteratura scientifica per quanto riguarda ricerche che sono in atto ora. Per l’uso terapeutico, sicuramente terapie CAR-T o comunque con linfociti modificati sono probabilmente abbastanza vicine dall’essere disponibili sul mercato, e CRISPR ha ridotto di molto, almeno in teoria, la barriera all’accesso; in particolare potrebbero essere significative per gli adenomi veri e propri più che per i tumori desmoidi. Gli adenomi e i carcinomi gastrici sono tra le neoplasie per cui sono già in atto test clinici in uomo con CAR-T: http://www.nature.com/nrclinonc/journal/v13/n6/abs/nrclinonc.2016.36.html , e l’utilizzo di CRISPR può solo aumentare la varietà dei bersagli e ridurre il costo di simili strategie.

      Ovviamente sarebbe molto meglio evitare l’insorgenza a monte, ma la cosa è decisamente più complessa. Le buone notizie sono due: la FAP fa parte di quel limitato numero di malattie (tra cui anche l’huntington) per cui sappiamo già molto bene quale bersaglio colpire, senza che il resto del genoma interferisca in maniera grave e significativa. L’altra buona notizia è che c’è già una combinazione farmacologica, adesso in test clinici di fase 3, cioè l’ultima fase pre-approvazione, che dovrebbe servire proprio a prevenire l’insorgere e il risorgere di tumori legati alla FAP: https://www.cancer.gov/about-cancer/treatment/clinical-trials/search/v?id=NCT01349881&r=
      Come in altri casi in cui parlo nel testo, questo è un buon segno perché le prime terapie con CRISPR saranno sicuramente versioni in terapia genica di bersagli già farmacologicamente validati.

      La cattiva notizia è che i meccanismi che si vanno a toccare, come spesso capita per i tumori, riguardano processi cellulari veramente base, la proliferazione, l’apoptosi, etc. Per cui bisogna vedere la tollerabilità della terapia, per cui serviranno altri studi nell’uomo, e vettori efficaci, perché la mutazione ad APC tu la hai in tutte le tue cellule ma idealmente sarebbe bene andare a riparare solo dove serve per evitare troppi effetti imprevisti, quindi principialmente intestino e colon-retto. E risolvere questi problemi sono cose che richiedono un sacco di tempo e di risorse, specialmente se a confronto con una terapia farmacologica.

      In qualche modo CRISPR sta già aiutando chi studia le tue mutazioni. C’è perfino sul mercato un Kit con CRISPR pronto all’uso: http://www.origene.com/CRISPR-CAS9/KN211629/APC.knockout , il che significa che studi che prima richiedevano mesi ora si possono fare in settimane, e che la velocità della ricerca sta accelerando. Questo purtroppo non significa direttamente che ci saranno nuove terapie dietro l’angolo, ma sono tutte frecce che aggiungiamo al nostro arco, che siano per la prevenzione o per il trattamento una volta che malauguratamente i polipi comincino a proliferare.

      Ti ringrazio del commento e ti auguro tutto il meglio per il futuro, Nimes.

  2. Nimes Franchi

    Sono io a doverti ringraziare per l’interesse, per avermi risposto in tempi rapidissimi e per la straordinaria umanità che hai dimostrato. Per chi non ha una cura (a meno che per cura non si intenda la prospettiva di invalidanti mutilazioni come l’asportazione del colon)avere anche una piccola speranza è fonte di immensa gioia. Se puoi ti chiedo di farmi sapere quando e se la terapia farmacologica in fase tre sarà approvata.
    Ti ringrazio ancora infinitamente.
    Nimes

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